Op 1 december 1940 verhuisde Otto zijn bedrijven Opekta en Pectacon van Singel 400 naar Prinsengracht 263. In de loop van 1942 werd begonnen met het inrichten van een schuilplaats op de eerste en tweede verdieping van het achterhuis, en op 6 juli dook het gezin Frank er onder. Op 13 juli volgde het gezin Van Pels (in het dagboek van Anne Frank de familie Van Daan genoemd), en in augustus werd een draaikast aangebracht die de toegang tot de onderduikruimte moest verbergen. In november dook Fritz Pfeffer, een kennis van Otto Frank, er ook onder. Slechts 4 medewerkers van Opekta waren op de hoogte van de aanwezigheid van de onderduikers. Op de begane grond van het achterhuis bevond zich een magazijn, en de onderduikers moesten daarom overdag heel stil zijn om hun aanwezigheid niet te verraden.

Het Anne Frank Huis staat in de schaduw van de Westertoren. In Annes dagboek is te lezen welke belangrijke rol de toren heeft gespeeld in haar onderduikperiode in het achterhuis.

Op 4 augustus 1944 viel Oberscharführer Karl met vier Nederlandse helpers het pand binnen, na een telefonische tip. Er was sprake van verraad. Alle onderduikers werden gearresteerd. Het dagboek van Anne Frank werd gered door Franks medewerksters Bep Voskuijl en Miep Gies.

Het huis na de oorlog

De twee bedrijven van Otto Frank verhuizen na de oorlog. Het pand Prinsengracht 263 staat leeg en dreigt te worden gesloopt. Door de succesvolle uitgave van het dagboek van Anne Frank wordt de onderduikplek zo beroemd dat hij wordt gered en gerestaureerd. In 1960 opent Het Anne Frank Huis zijn deuren.